自(zi)聚合酶鏈式反(fan)應(ying)（PCR）技術問世以來，其在生(sheng)命科學、臨床診(zhen)斷和食品安全檢測領域(yu)產生(sheng)了革命性(xing)的(de)影響。實時熒光定量PCR儀（Real-Time Quantitative PCR，簡稱qPCR儀）是在傳統(tong)PCR技術基礎(chu)上發展(zhan)起來的(de)新(xin)一(yi)代(dai)核(he)酸定量分析儀器，通過(guo)實時監(jian)測熒光信號的(de)變化，實現對目標核(he)酸分子的(de)精確定量，已成為現代(dai)分子生(sheng)物(wu)學實驗室的(de)核(he)心(xin)設備。
技術(shu)原理
實(shi)(shi)時(shi)(shi)熒(ying)光(guang)(guang)定量PCR的(de)(de)核(he)心原理(li)是將PCR擴增(zeng)過(guo)程與熒(ying)光(guang)(guang)檢測(ce)系統實(shi)(shi)時(shi)(shi)結合。在每個PCR擴增(zeng)循(xun)環中(zhong)，儀器(qi)的(de)(de)光(guang)(guang)學(xue)系統會檢測(ce)反應體(ti)系中(zhong)熒(ying)光(guang)(guang)信號的(de)(de)強度變(bian)化。當(dang)熒(ying)光(guang)(guang)信號超過(guo)設定的(de)(de)閾值（即Ct值）時(shi)(shi)，意味著擴增(zeng)產物(wu)已積(ji)累到(dao)可檢測(ce)水平(ping)。通過(guo)標(biao)準(zhun)(zhun)曲(qu)線法(fa)或相對定量法(fa)，將Ct值轉換為目標(biao)核(he)酸的(de)(de)起(qi)始拷貝數，從而實(shi)(shi)現準(zhun)(zhun)確定量。
常(chang)用的熒(ying)光檢(jian)測(ce)化學方法包(bao)括(kuo)：SYBR Green染料法（與(yu)雙鏈DNA非特異性結合(he)）和(he)TaqMan探針(zhen)法（特異性熒(ying)光標記探針(zhen)，靈(ling)敏度和(he)特異性更高）。此(ci)外還有Molecular Beacon、LUX引物等(deng)多種檢(jian)測(ce)方式，可根據(ju)實驗(yan)需求靈(ling)活選擇。
儀(yi)器結構與關鍵(jian)組件
熱循環(huan)模塊：采用半導體制(zhi)冷技術或氣流(liu)制(zhi)冷技術，實(shi)現快速精準的(de)溫度(du)循環(huan)控制(zhi)。高(gao)性能機型的(de)升降溫速率可達3-5°C/秒，溫度(du)均一(yi)性控制(zhi)在(zai)±0.1°C以(yi)內(nei)，確(que)保96孔(kong)或384孔(kong)板各位置的(de)擴增(zeng)效(xiao)率一(yi)致。
光學(xue)檢測(ce)系(xi)統：配備高(gao)靈敏度CCD相機(ji)或光電倍增管（PMT），配合(he)激發(fa)光源（LED或鹵(lu)素燈）和多通(tong)道(dao)濾光片組(zu)，可同時檢測(ce)多種熒光染料的信號，支(zhi)持多重PCR反應。
數據分析軟件：提供(gong)自動(dong)基線設定、閾(yu)值計(ji)(ji)算、標準曲(qu)(qu)線繪制、熔解(jie)曲(qu)(qu)線分析和統計(ji)(ji)報告生成等(deng)功能，用戶界面友好，操作便(bian)捷(jie)。
主要應(ying)用領(ling)域
臨床診(zhen)斷(duan)：病(bing)毒（如新冠病(bing)毒、流(liu)感(gan)病(bing)毒、HPV等）和細菌的核酸檢(jian)測，基因突(tu)變檢(jian)測，腫(zhong)瘤標志(zhi)物定量(liang)分析。
科學研究：基因表(biao)達量(liang)分析(xi)、基因拷貝數變異（CNV）檢測、甲(jia)基化(hua)分析(xi)、microRNA定量(liang)等。
食品安全：轉基因成分檢測(ce)(ce)、食源性病(bing)原體(ti)（沙門(men)氏(shi)菌、大腸桿菌等(deng)）定量檢測(ce)(ce)。
農業育(yu)種：品種鑒定、抗性基因篩查、植(zhi)物病害快速(su)診斷。
法(fa)醫鑒(jian)定：微量(liang)DNA樣本的物種鑒(jian)別(bie)和個體(ti)識別(bie)。
選購要(yao)點(dian)
選購實(shi)時熒(ying)光定量PCR儀應重點(dian)關注：孔板(ban)規格（96孔/384孔）、熒(ying)光通道數(shu)(shu)量（4-6通道滿足(zu)多重檢(jian)測(ce)需求）、升降(jiang)溫速率、溫度均一性、靈敏度以及(ji)軟件的兼容(rong)性和(he)數(shu)(shu)據分析功能。對于高通量實(shi)驗室，還應考慮自(zi)動化整合能力。
發展展望
數字PCR（dPCR）技(ji)術的(de)興(xing)起(qi)為核酸(suan)絕對定量(liang)提供了新的(de)解決方(fang)案，但(dan)實時熒光定量(liang)PCR憑(ping)借其成(cheng)熟的(de)技(ji)術體系、廣泛的(de)適用性和較低的(de)運營成(cheng)本(ben)，在可預(yu)見的(de)未來(lai)仍將是基(ji)因檢測(ce)領(ling)域的(de)主(zhu)流平(ping)臺(tai)。集成(cheng)人工(gong)智(zhi)能算法的(de)智(zhi)能分析系統將進一步(bu)降低操作門檻(jian)，提高檢測(ce)的(de)標準化水(shui)平(ping)。
